روش شمارش گلبول های قرمز

ب – مقدمه  :

هدف از شمارش گویچه های خون، شمردن و تعیین تعداد گلبولهای قرمز در یک میلیمتر مکعب خون است.

گلبولهای قرمز (گویچه های سرخ) اریتروسیت –و Red Blood-Cell  (R.B.C) نیز نامیده می شوند. گلبولهای قرمز سلولهائی بدون هسته و بشکل صفحات مقعر الطرفین (دیسک مانند) می باشند. اندازه آنها ۷×۲ میکرون (شکل ۵-۱) و محل ساخته شدن آنها در افراد بالغ مغز استخوان می باشد. گلبولهای قرمز در زیر میکروسکوپ برنگ زرد نارنجی دیده می شوند تعداد گلبولهای قرمز در مردان ۳/۰±۲/۵ میلیون و در زنان ۳/۰±۷/۴ میلیون می باشد.

شکل ۵-۱: گلبول قرمز

کار اصلی گلبولهای قرمز انتقال اکسیژن از ریه به بافتها جهت متابولیسم است. همچنین انتقال بخشی از گازکربنیک بافتها به ریه بوسیله گلبولهای قرمز انجام می شود . گلبولهای قرمز یکی از عوامل تعیین کننده ویسکوزیته خون می باشند .

تعداد گلبولهای قرمز ممکن است افزایش یابد که به آن پلی سیتمی یا اریترمی می گویند که دو نوع است:

• پلی سیتمی فیزیولوژیک که در اثر نیاز بدن به اکسیژن ایجاد می شود مثل زندگی در ارتفاعات.
• پلی سیتمی ورا (حقیقی) که در اثر سرطانی شدن سلولهای ایجاد کننده گلبولهای قرمز ایجاد می شود.

اگر تعداد گلبولهای قرمز کم شود آنمی نام دارد. آنمی ممکن است بعلل گوناگون ایجاد شود که بطور خلاصه بشرح زیر است:

• آنمی ناشی از خونریزی
• آنمی ناشی از آپلازی (از کار افتادن) مغز استخوان
• آنمی بعلت نارس بودن گویچه ها مثل آنمی پرنیسیوز که در اثر عدم جذب ویتامین B₁₂ و اسید فولیک ایجاد می شود.
• آنمی ناشی از همولیز گویچه ها، انواع مختلف آنمی همولیتیک عبارتند از: آنمی میکروسیتر (اسفروسیتوز) – آنمی داسی شکل (sickle cell) – تالاسمی (Cooley a)- اریتروبلاستوز جنینی

پ – اساس آزمایش :

رقیق کردن خون با محلول رقیق کننده و شمارش گلبول های قرمز در حجم مشخص خون

ت- وسایل لازم برای انجام آزمایش 

۱-   سرنگ استریل ۵ سی سی              ۱ عدد

۲-  پنبه

۳ –   الکل ۷۰ درصد

۴ –  خون                                    ۴ سی سی

۵ –  محلول آب مقطر

۶ –    کلرور سدیم

۷ –  لوله آزمایش سیتراته               ۲ عدد

۸ – چسب مخصوص پانسمان محل خونگیری

۹ – گارو یا تورنیکت برای انجام خونگیری

۱۰ – لام نئو بار یا لام هموسیتومتر

۱۱ – لامل

۱۲ – کاغذ خشک کن  یا کاغذ نم گیر

۱۳ – میکرسکپ نوری

۱۴– ملانژور قرمز یا پی پت رقیق کننده مخصوص گلبول های قرمز

۱۵ – شیلنگ ملانژور

۱۶ – محلول سرم فیزیولوژی

۱۷ – ماشین حساب ساده

ث – روش انجام  آزمایش :

۱- از فرد داوطلب ۳ سی سی خون وریدی می گیریم و آن را داخل دو لوله ازمایش سیتراته می ریزیم و با  یک دقیقه سروته کردن  آرام ، خون را با محلول ضد انعقاد داخل لوله ،  مخلوط می کنیم .

۲ – محلول هیپر تونیک کلرور سدیم ۲ درصد را به عنوان یک محلول رقیق کننده ،  آماده می کنیم .

نکته: برای دقت بیشتر در آزمایش ، حتما هر دانشجو از یک لوله آزمایش محتوی محلول کلور سدیم  ۲ درصد  استفاده کند .

 

۳ – لام نئو بار (    neubaure ) را تمیز و خشک می کنیم .

نکته  ۱ : لام نئوبار را پس از تمیز کردن زیر میکروسکوپ گذاشته و با ابژکیتو درشنمایی ×۱۰ نگاه می کنیم . با این درشت نمائی تمام مربع بزرگ در میدان میکروسکوپ دیده می شود در این حالت به تقسیم بندی لام توجه کرده و آن را به ذهن می سپاریم .

نکته : به دانشجویان گرامی توصیه می شود که قبل از شروع به شمارش ، با مربع های مختلف شمارش سلولی

و ابعاد آنها آشنا شوند  .

انواع مختلف لام هموسیتومتر وجود دارد که بیشتر از لام  نئوبار استفاده می شود .

لام نئو بار صفحه شیشه ای ضخیمی است که در قسمت یک سوم میانی آن سه سکوی موازی وجود دارد که بوسیله شیارهای کم عمق از یکدیگر جدا شده اند و سکوی میانی ^mm1/0 از دو سکوی دیگر پایین تر است و دو سکوی دیگر لامل را نگه میدارند.

این سکو ی میانی  بوسیله یک شیار عرضی کوتاه به دو قسمت تقسیم می شود. با گذاشتن لامل ^mm1/0 فاصله بین لام و لامل ایجاد می شود. (شکل ۲-۱)

 

 

شکل ۲-۱: لام شمارش سلولی ( لام نئوبار )

 

هر یک از محلهای علامت گذاری شده در شکل با چشم غیر مسلح بشکل بعلاوه (+) دیده می شود .  جدول لام نئو بار از یک مربع بزرگ تشکیل شده است . طول ضلع این مربع بزرگ ۳ میلیمتر است . این مربع بزرگ توسط ۴ خط سه تایی موازی عمودی و افقی به ۹ مربع متوسط تقسیم شده اند . طول ضلع هر مربع متوسط  ۱ میلیمتر است . از مربع های متوسط چهار گوشه مربع بزرگ  ، برای شمارش گلبول های سفید و از مربع متوسط مرکزی برای شمارش گلبول های قرمز استفاده می شود . مربع متوسط مرکزی خود به ۲۵ مربع کوچک تقسیم شده و هر مربع کوچک ، خود به ۱۶ مربع خیلی کوچک تقسیم شده است .برای شمارش گلبول های قرمز از چهار مربع کوچک در چهار گوشه و مربع مرکزی کوچک استفاده شده و تعدادگلبول های قرمز را در این ۵ مربع کوچک می شماریم . در واقع تعدادگلبول های قرمز را در ۸۰ مربع خیلی کوچک ( ۸۰=۱۶*۵ ) واقع در مربع متوسط مرکزی شمارش می شوند .

 

شکل ۳-۱: لام نئوبار اصلاح شده

 

۴ – با ملانژور قرمز ( به کمک شلنگ ملانژور )   با مکش ملایم ،  تا درجه ۰٫۵  پی پت خون می کشیم . نوک ملانژور را با پنبه خشک تمیز می کنیم . سپس ملانژور را تا درجه ۱۰۱ از محلول رقیق کننده کلرور سدیم ۲ درصد پر می کنیم . با این  کار ،  خون را ۲۰۰ بار رقیق می کنیم .

نکته : در موقع پرکردن ملانژور توجه شود حباب یا فاصله بوجود نیاید .

نکته : در زمان استفاده ،  ملانژور و شیلنگ آن خشک باشند .

چون حدود ۴۵% حجم خون از سلولها تشکیل می شود که قسمت اعظم آنها گلبولهای قرمز هستند اگر خون را بطور مستقیم زیر میکروسکوپ نگاه کنیم گلبولها بهم فشرده هستند  و شمارش آن غیر ممکن است  . بدین جهت ابتدا خون را بوسیله مایع رقیق کننده مخصوص ۲۰۰ بار رقیق کرده سپس روی لام مخصوص شمارش گلبولی بوسیله میکروسکوپ شمارش گلبولهای قرمز را انجام میدهیم .

 

۵ – دو سر ملانژور را با انگشت شست و اشاره گرفته و به مدت ۵ دقیقه تکان می دهم تا خون به خوبی رقیق شود .

۶ –  یک لامل تمیز را روی لام نئو بار قرار می دهیم .

۷ –  با دمیدن آرام در ملانژور چند قطره ابتدایی مایع را دور ریخته (۵-۴ قطره) و در حالیکه قطره کوچکی از خون رقیق شده از نوک پیپت آویزان است نوک ملانژور را به شیار بین لام و لامل نزدیک می کنیم ، خون رقیق شده  به زیر لامل کشیده می شود . بعد لامل را کمی از دو طرف فشار میدهیم تا  اگر مایع اضافی زیر لامل باشد ،  به شیارهای دو طرف بریزد .

نکته : بعد از این مرحله  ،  لامل روی لام جابجا نشود .

۸ –  دوباره لام را زیر میکرسکوپ گذاشته و با ابژکتیو ×۴۰ میزان می کنیم و با استفاده از پیچهای حرکت دهنده میکروسکوپ یک مجموعه ۱۶ تایی از مربع های کوچک موجود در یکی از گوشه های مربع اصلی را در زیر میکروسکوپ تنظیم کرده و گلبولهای قرمز آن را بترتیب از راست به چپ و از بالا به پائین بطور زیگزاگی می شماریم ( شکل ۶-۱) و یاداشت می کنیم  .

نکته  :  برای شمارش گویچه های موجود بر روی چهار ضلع اطراف این مجموعه ،  گویچه های سرخ موجود بر روی یک ضلع افقی و عمودی را می شماریم و به عدد بدست آمده اضافه می کنیم . تعداد گویچه های سرخ مجموعه های ۱۶ خانه ای کوچک موجود در سه گوشه دیگر مربع اصلی و یک مجموعه ۱۶ تائی از وسط مربع بزرگ را به طریق فوق می شماریم و در جدول پیوست  یادداشت می کنیم .  به این ترتیب تعداد گویچه های موجود در ۸۰=۱۶×۵ مربع کوچک را شمرده ایم .

شکل ۶-۱: نشست گلبولها و روش شمارش آنها

۹-  روش  محاسبه:

می دانیم که طول هر ضلع مربع متوسط مرکزی ۱ میلی متر است .

و طول ضلع یک مربع کوچک   یک پنجم میلیمتر است .

وطول یک ضلع یک مربع خیلی کوچک یک چهارم میلیمتر است .

 

 

 

۸ – توجهات  کلی  برای تمام آزمایشات   :

–   وسایل غیر مصرفی رابه خوبی  تمیز کرده و در محل مخصوص خود قرار می دهیم .

–   محیط کار را تمیز و مرتب می کنیم .

– وسایل مصرفی برنده و نوک تیز را در ظرف مخصوص می اندازیم و سایر مسایل مصرفی را دور میریزیم .

۱۱ –  همیشه  بعد از پایان کار با میکرسکپ :

– میکرسکپ  را خاموش کرده و برق آن را نیز قطع می کنیم .

– آن  را تمیز می نماییم  .

–  کاور آن را می گذاریم .

ج –  پرسش ها :

۱- چرا در این آزمایش رقیق کردن خون لازم است ؟

۲ – تعدادگلبول قرمز بدست آمده را در عدد ۱۰۰۰۰ ضرب می کنیم . چرا ؟

۳ – تعداد نرمال گلبول های قرمز در یک میلیمتر مکعب چقدر است  ؟