محیط های کشت انتخابی
۱ -آب پپتونه قلیایی(APW) Water AIkaline Peptone
۲ -محیط کشت آگار دار ( TCBS)
نحوه کشت مدفوع
۱ – نمونه مدفوع و سوآپ رکتال را روی محیط (TCBS) برده و ایزوله نموده سپس مقداری هم داخل محیط APW ) )
تلقیح نمایید (تلقیح مدفوع نباید از ۱۰% کل حجم آبگوشت بیشتر باشد)
۲ – در پیچ لوله (APW) را نیمه باز به مدت ۶ الی ۸ ساعت در ۳۵ درجه انکوبه نموده و نمونه را جهت کشت روی( TCBS) آماده کنید.
۳ – حلقه رویی تشکیل شده در( APW) که غنی از ویبریو است را روی محیط ( TCBS) کشت دهید توجه شود که (APW) را نباید به هم زد یا مخلوط نمود. ضمناً در صورت عدم انتقال به مدت ۶ الی ۸ ساعت انکوباسیون بایستی پس از ۱۸ ساعت و تشکیل حلقه کامل، آن را روی (APW) دوم برده و ۶ الی ۸ ساعت بعد عمل انتقال ( TCBS) را انجام دهید، که سبب تاخیر مراحل تشخیصی میشود.
۴ – محیط ( TCBS) اولیه و همچنین ( TCBS) ساب کالچر از( APW) را بعد از ۱۸ الی ۲۴ انکوباسیون جهت دیدن کلنی های زرد براق بررسی نمایید رنگ زرد کلنی نشانه تخمیر سوکروز محیط است.
۵ – توجه شود کلنی های به غیر از رنگ زرد (عدم تخمیر سوکروز) جهت شناسایی افتراقی ویبریو بکار گرفته نمی شود.
جداسازی ویبر یوکلرای مشکوک
۱ – از کلنی زرد توسط آنس نوک تیز بدون تماس با سطح ( TCBS) نمونه را برداشته و در محیط KIAو
(HIA) Agar Infusion Heart یا محیط غیر انتخابی دیگر به جز محیط های آگار مغذی که نمک اضافی ندارند کشت دهید
۲ – محیط کشت HIA KIA ,را به مدت ۲۴ ساعت در ۳۵ درجه انکوبه نموده و کلنی هایی که در روی KIAبصورت K/A ( سطح قرمز و عمق زرد)میباشد را از نظر سرم شناختی با آنتی سرم های چند ظرفیت O1و O139 مورد مطالعه قرار دهید (از روی محیط (HIA.
۳ – اگر موجودی آنتی سرم ها محدود باشد آزمایش اکسیداز برای غربالگری موارد جدا شده پیش از آزمایش با آنتی سرم کمک کننده است.
آزمایش اکسیداز
برای آزمایش اکسیداز از کلنی های رشد کرده روی (HIA) استفاده می شود.
توجه: دقت شود که از کلنی های رشد کرده روی ( TCBS) مستقیماً نمی توان این قسمت را انجام داد زیرا نتایج مثبت یا منفی کاذب می دهد.
روش آزمایش: ۳ تا ۴ قطره از معرف اکسیداز را روی تکه کاغذ صافی ریخته در یک پلیت قرار دهید و بوسیله یک اپلیکاتور پلاستیکی استریل با بخش چوبی سوآپ یا خلال دندان کلنی را برداشته و روی کاغذ حل نمائید رنگ ارغوانی بلافاصله پدیدار خواهد شد.
آزمایشات اضافی بیوشیمایی جهت غربالگری
۱ – واکنش رشته(جهت رد گونه های غیر ویبریو به ویژه آئروموناس)
روش: روی لام یا پلیت خالی یک دو قطره از محلول آبی نیم درصد دزوکسی کلات سدیم ریخته و کلنی تازه رشد کرده روی(HIA) را در آن حل می نمائیم اگر سوسپانسیون کدورتش از بین برود DNA باکتریها آزاد شده موجب لزج شدن مخلوط گردیده و تشکیل یک رشته موکوئیدی می دهد این تست در ویبریوکلرا مثبت می باشد.
محیط های KIA ,و TSIبرای رد کردن گونه های پسودوموناس و برخی انتروباکتریاسه های خاص استفاده می شود در محیط KIA رشد کلنی
۲ – محیط های KIA و TSI برای رد کردن گونه های پسودوموناس و برخی ابتروباکتریاسه های خاص استفاد می شود در محیط KIA رشد کلنی بصورت K/A بوده (سطح قرمز عمق زرد) وایجاد گاز H2S نمی نماید. در محیطTSI رشد کلنی بصورت A/A بوده ( سطح زرد عمق زرد) و گاز H2S تولید نمی کند.
توجه: هنگام انکوباسیون در ۳۵ درجه درب این محیط ها شل باشد زیرا در شرایط بی هوازی واکنش های متفاوت رخ خواهد داد
۳ – محیط LIA برای رد کردن آئروموناس و برخی گونه های ویبریوکلرا که بر خلاف ویبریوکلرا لیزین را دکربوکسیله نمی کنند استفاده می شود واکنش ویبریوکلرا با لیزین بصورت K/K می باشد.
رنگ آمیزی گرم
باکتریهای ویبریو شکل میله ای خمیده و کوچک و گرم منفی می باشند ریختن کریستال ویوله جهت رویت شکل باکتری نیز بعنوان روش سریع کاربرد دارد.
آزمایش مستقیم مدفوع
میکروسکوپ Dark Fieid (زمینه تاریک) و فاز کنتراست برای رویت مستقیم باکتری بکار می رود که در آن باکتریها بصورت خمیده و حرکت پرشی (شبیه شهاب سنگ) دیده میشود.
شناسایی سرم شناختی(سروتایپینگ) ویبریوکلرای O1 و O139
نکته قابل توجه در این مرحله:
۱ -استفاده از کلنی های تازه رشد کرده در محیط های انتخابی آگار(HIA,KIA,TSI) است. استفاده از کلنی های TCBS موجب جواب های مثبت یا منفی کاذب می گردد.
۲ – تنها در صورتی از آنتی سرمهای تک ظرفیتی اگاوا و اینابا استفاده می شود که آزمون آنتی سرم چند ظرفیتی O1 مثبت باشد.
تائید ویبریوکلرO1 با استفاده از آنتی سرم های اگاوا و اینابا
گروه سرمی O1 به سه سروتیپ اینابا ، اگاوا و هیکوجیما (بسیار نادر) تقسیم بندی می شود. شناسایی بر اساس واکنش مثبت با هر یک از آنتی سرم ها برای تائید شناسایی مورد جدا شده ویبریوکلرا کفایت می کند .
توجه: موارد جدا شده ای که با آنتی سرم گروه سرمی O1 آگلوتیناسیون خفیف می دهد اما با آنتی سرم های اگاوا و اینابا آگلوتیناسیون می دهد جزء گروه سرمی O1 نمی باشد. بنابراین هرگز نباید از آنتی سرم های اگاوا و اینابا برای سوشهایی که با آنتی سرم های پلی والان (چند ظرفیتی) O1 پاسخ منفی داده اند استفاده کرد در ضمن آگلوتیناسیون بایستی قوی و سریع باشد.
روش آگلوتیناسیون روی لام
کلنی های رشد کرده روی محیط های (HIA,KIA,TSI) را با یک اپلیکاتور چوبی یا خلال دندان در دو قطره نرمال سالین قرار داده شده روی لام حل کرده و سوسپانسیون تهیه کنیم ابتدا سوسپانسیون را به دقت بررسی کرده و از نظر عدم وجود توده مطمئن می شویم سپس یک قطره از آنتی سرم را روی سوسپانسیون ریخته و با تکان دادن لام آگلوتیناسیون را در مدت ۳۰ ثانیه الی ۱ دقیقه بررسی کنید.
* سرو تیپ های O1 و O139 تولید کننده سم وبا هستند و از نظر کلینیکی اهمیت دارند.
