رنگ‌آمیزی گرم یکی از مهم ترین و متداولترین روشهای رنگ آمیزی در علم میکروب شناسی است که برای اولین بار در سال ۱۸۸۴ توسط پزشک و میکروب شناس دانمارکی بنام هانس کریستین گرم (Hans Christian Gram ) موقع رنگ آمیزی برای متمایز کردن باکتریهای مولد ذات الریه از هسته سلولهای میزبان ابداع شد . این رنگ آمیزی که مهمترین و کاربردی ترین رنگ آمیزی افتراقی میکروب شناسی است . در حالت کلی باکتری ها را به دو دسته یا گروه بزرگ گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می کند در سال ۱۹۲۱هوکر (George J. Hucker) میکروب شناس آمریکایی با اصلاحات جزئی در روش رنگ آمیزی گرم ارتقاء و بهبود این روش شد. در آزمایشگاه میکروب شناسی بالینی، رنگ آمیزی گرم آزمایشی مهم برای تشخیص احتمالی سریع عوامل عفونی است. این آزمایش برای طبقه بندی باکتری ها بر اساس شکل، اندازه، مورفولوژی سلول و واکنش گرم آنها به کار می رود.
اساس روش رنگ آمیزی گرم، ناشی از تفاوت ساختاری در یواره سلولی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت است. به این ترتیب که ضخامت لایه پپتیدوگلیکان (ترکیب اصلی دیواره سلولی) در باکتریهای گرم مثبت خیلی بیشتر از باکتریهای گرم منفی می باشد لذا اساس رنگ آمیزی گرم به ساختمان و ترکیب دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . در این روش ابتدا رنگ بازی کریستال ویوله بکار می رود که همه باکتریهای کشته شده و تثبیت شده بر روی لام آن را جذب می نمایند و سپس محلول رقیق ید به عنوان دندانه (Mordant) افزوده می شود که رسوبی از کمپلکس کریستال ویوله و ید در پروتوپلاسم تشکیل می دهد. در مرحله بعدی رنگ آمیزی وقتی که از رنگبر استفاده می شود در باکتری های گرم مثبت ساختار شیمیایی اصلی دیواره، یعنی پپتیدوگلیکان، لایه ای ضخیم است و پس از متراکم شدن در اثر آبگیری با رنگبری، نفوذناپذیر شده و مانع از خروج کمپلکس کریستال ویوله و ید از سلول می شود. ولی در دیواره سلولهای گرم منفی، پپتیدوگلیکان لایه ظریفی از دیواره را تشکیل می دهد و بقیه دیواره از جنس چربی هاست که در رنگبر حل شده و از بین می رود و لذا امکان رخنه افزایش یافته و کمپلکس کریستال ویوله ید به راحتی از پروتوپلاسم شسته شده و از سلول خارج می شود. تا بدین مرحله گرم منفی ها بی رنگ شده و گرم مثبت ها همچنان بنفش باقی مانده اند.
در مرحله پایانی رنگ آمیزی، از رنگ ثانویه یا رنگ مخالف (Counterstain) استفاده می شود و باکتری های گرم منفی که کمپلکس رنگی خود را از دست داده اند در نتیجه افزودن رنگ قرمز سافرانین، قرمز رنگ می شوند )گرم منفی(. ولی باکتری هایی که در اثر افزودن رنگبر (Decolorizer)، رنگ خود را از دست نداده اند با افزودن رنگ سافرانین، همچنان رنگ قبلی یعنی بنفش را نگه داشته و نشان می دهند )گرم مثبت(..
اکثر باکتریهای شناخته شده ، گرم منفی هستند البته برخی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.
تفسیر گسترش هایی که رنگ آمیزی گرم شده اند، با در نظر گرفتن مشخصه های رنگ آمیزی ، اندازه، شکل و آرایش سلول صورت می گیرد. این مشخصه ها ممکن است بوسیله بسیاری از فاکتورها مانند مدت زمان ماندگی باکتری در محیط کشت، نوع محیط کشت، اتمسفر انکوباسیون، روش رنگ آمیزی و وجود مواد مهارکننده تحت تأثیر قرار بگیرند. برای تفسیر اسمیرهای تهیه شده از نمونه های بالینی مانند خلط، به وجود عوامل اضافی مانند انواع سلول های میزبان و فاگوسیتوز نیز می بایست دقت نمود .
شکل ۱- تفاوت ساختاری دیواره سلولی باکتری های گرم منفی و گرم مثبت |
اسمیر برای رنگ آمیزی گرم ممکن است از نمونه های بالینی، محیط براث یا کلنی های رشد کرده روی محیط کشت جامد تهیه شود. نمونه های بالینی تازه وکشت های تازه (کمتر از ۲۴ ساعت) از محیط های غیرمهارکننده ، صحیح ترین نتایج را می دهند؛برای برخی بررسی های مورفولوژیکی، اسمیر تهیه شده از کشت براث مورد نیاز می باشد.
- معرف ها و محلولهای مورد نیاز:
معرف ها ممکن است به صورت تجاری خریداری شوند یا در آزمایشگاه تهیه گردند.
- محلول کریستال ویوله
طرز تهیه:
- پودر کریستال ویوله ۲۰ گرم
- اتانول۹۶ درجه ۱۰۰ میلی لیتر
محلول ذخیره و مصرفی کریستال ویوله، در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری میشود.
تهیه اگزالات آمونیوم
- پودر اگزالات آمونیوم یک گرم
- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر
هنگام مصرف، محلول کریستال ویوله ذخیره را به نسبت ۱:۱۰ با آب مقطر رقیق نمایید. (۱ میلی لیتر از محلول کریستال ویوله و ۹ میلی لیتر آب مقطر) سپس این محلول را با چهار حجم از محلول اگزالات آمونیم رقیق کنید (۱ میلی لیتر محلول کریستال ویوله رقیق شده و ۴ میلی لیتر اگزالات آمونیم).
- محلول لوگل
روش تهیه:
- ید ۱ گرم
- یدور پتاسیم ۲ گرم
- آب مقطر ۲۴۰ میلی لیتر
- محلول آبی بیکربنات سدیم۵% ۶۰ میلی لیتر
- در مقدار کمی از آب مقطر، ید و یدور پتاسیم را کاملاً حل نمایید، بعد حجم را با آب مقطر به ۲۴۰ میلی لیتر برسانید. محلول ۵% بیکربنات سدیم (بیکربنات سدیم: ۵ گرم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر) را نیز به آن اضافه نمایید. محلول در دمای اتاق نگهداری می شود . درب آنرا باید کاملا” محکم ببندید.
احتیاط: ید خاصیت خورندگی دارد. از استنشاق، خوردن یا تماس آن با پوست خودداری کنید.
- رنگ بر
- الکل ـ استون
حجم مساوی از الکل اتیلیک (اتانول) را با استون بسته به نیاز مخلوط نمایید. مثلا” مخلوطی از ml 100 اتانول و ml100 استون را در بطری شیشه ای قهوه ای رنگ ترکیب کنید، با یک سال تاریخ انقضاء، برچسب بزنید و در حرارت اتاق نگهداری کنید.
- رنگ متقابل یا رنگ ثانویه (Counterstains)
روش تهیه فوشین ذخیره:
- پودر فوشین ۲ گرم
- اتانول ۱۰۰ میلی لیتر
روش تهیه سافرانین ذخیره:
- پودر سافرانین ۵/۲ (دو ونیم ) گرم
- اتانول ۱۰۰ میلی لیتر
به هنگام مصرف، محلول ذخیره فوشین یا محلول ذخیره سافرانین را به نسبت ۱:۱۰ با آب مقطر رقیق نمایید. محلولها در ظروف تیره، تهیه و در دمای اتاق ذخیره می شوند.
- وسایل و مواد مورد نیاز
- لام شیشه ای ( mm75×۲۵)
- NaCl 85/0% (سرم فیزیولوژی) استریل
- پی پت پاستور و اپلیکاتور چوبی استریل
- لوپ میکروب شناسی، آنس تلقیح سازی
- Safety box برای دور ریختن زباله بیولوژیک شامل وسایل نوک تیز
- روغن ایمرسیون
- متانول خالص
نکته: متانول را در بطری های درپیچ دار قهوه ای ذخیره کنید. ذخیره کاری را می توان در ظروف پلاستیکی برای حداکثر دو هفته ذخیره نمود .
- تجهیزات مورد نیاز با توجه به نوع نمونه:
- سانتریفوژ
- ورتکس
- لوله درپیچ دار استریل
- قیچی، اسکالپل و پنس استریل
- خردکن بافت
روش انجام آزمایش:
الف– تهیه گسترش :
اسمیر مناسب باید لایه ای از ارگانیسم ها با تراکم مناسب برای مشاهده آسان ایجاد نماید. پراکندگی ارگانیسم ها می بایست به نحوی باشد که آرایش آنها مشخص شود. برای تهیه اسمیر از لام های شیشه ای نو و تمیز استفاده نمایید.
نکته: زمانی که از یک پی پت یا سواب برای تهیه اسمیر و تلقیح محیط کشت استفاده می کنید، همیشه قبل از تهیه اسمیر، ابتدا محیط کشت را تلقیح کنید.
۱– نمونه های بالینی برای رنگ آمیزی گرم:
نکته : استفاده از دستکش لاتکس در زمان کار روی نمونه های بالینی ضروری است .
- نمونه های دریافت شده با سواب
در اینگونه موارد بهتر است یک سواب جداگانه برای تهیه اسمیر آماده شود .
الف- جهت جلوگیری از تخریب عناصر سلولی و از بین رفتن آرایش باکتریایی، به آرامی سواب را در سرتاسر لام بچرخانید.
- در مواردی که فقط یک سواب دریافت می شود، سواب را در مقدار کمی سرم فیزیولوژی استریل قرار داده و آن را ورتکس کنید. سواب را به دیواره داخلی لوله بفشارید و آن را برای تهیه گسترش به کار ببرید. از باقیمانده سوسپانسیون برای تلقیح در محیط کشت استفاده کنید.
نمونه هایی که با سواب دریافت نمی شوند شامل: آسپیره ها، ترشحات، چرک، مدفوع
- اگر نمونه در یک سرنگ دریافت شده باشد، ابتدا تمامی آن را در یک لوله استریل بریزید. در صورت کافی بودن حجم نمونه آن را ورتکس کنید.
نکته: سرنگ های همراه سرسوزن را ، نپذیرید. به کارکنان مربوطه جداسازی ایمن سرسوزن ها را آموزش دهید .
- با استفاده از یک اپلیکاتور، پی پت یا لوپ سیمی استریل قسمت های چرکی یا خونی نمونه را انتخاب کنید. نمونه های خیلی غلیظ یا نمونه های چرکی را می توان در یک قطره سرم فیزیولوژی استریل روی لام رقیق نمود تا تهیه اسمیر آسان تر شود.
- نمونه را روی منطقه بزرگی از لام پهن کنید تا یک لایه نازک ایجاد شود.
- نمونه CSF و سایر مایعات بدن که نیاز به سانتریفوژ دارند
بعضی از آزمایشگاهها ممکن است برای تغلیظ مایعات بدن و تهیه اسمیر از Cytopsin Slide Centrifuge استفاده کنند. این روش به افزایش حساسیت رنگ گرم ،کاهش زمان سانتریفوژ و دسترسی سریعتر به نتیجه کمک می نماید.
- بعد از انجام سانتریفوژ، با استفاده از پی پت استریل، محلول رویی را به یک لوله استریل منتقل کنید، حدود ۵/۰ ملی لیتر را به عنوان رسوب باقی بگذارید.
- رسوب را ورتکس کرده یا با چند بار داخل و خارج کردن از یک پی پت پاستور استریل آنرا کاملا مخلوط نمایید.
- با استفاده از پی پت پاستور یک قطره کوچک از رسوب را روی یک لام تمیز قرار دهید.
- قطره را پخش نکنید. اجازه دهید تا در مجاورت هوا خشک شود.
- نمونه های ادرار
بدون سانتریفوژ کردن نمونه را به خوبی مخلوط کرده با استفاده از یک پی پت پاستور استریل یک قطره از آن را روی لام قرار دهید و قطره را پخش نکنید. اجازه دهید قطره در مجاورت هوا خشک شود.
مواد خشک یا مقادیر خیلی کم نمونه های بالینی:
- نمونه را در ۵/۰ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل کنید. در صورت نیاز ورتکس نمایید.
- با استفاده از پی پت پاستور استریل یک قطره را روی لام قرار دهید.
- با استفاده از نوک پی پت، قطره را پخش کنید تا لایه نازکی ایجاد شود.
- بیوپسی ها و برش های بافت
تهیه نمونه حاصل از تماس مستقیم اسلاید با سطح نمونه (touch prep) و یا نمونه خرد شده (ground specimen)
- بافت را با استفاده از قیچی یا اسکالپل استریل خرد کنید.
- نمونه ای حاصل از تماس مستقیم اسلاید با سطح نمونه (touch prep) تهیه کنید. با استفاده از پنس استریل قطعه ها را نگه دارید و کناره های یک یا تعداد بیشتری از قطعات خرد شده را با اسلاید شیشه ای استریل تماس دهید، برای بررسی آسانتر تماس ها را با هم دسته بندی کنید.
- برای نمونه های تماسی یکنواخت، یک قطره را روی اسلاید قرار دهید و به اندازه یک دایرهای به قطر ۵/۲ سانتی متری پخش کنید.
- نمونه های برداشت شده از محیط های کشت:
- نمونه های برداشت شده از محیط های کشت براث:
پس از مخلوط کردن محیط کشت با استفاده از پی پت پاستور استریل (یا یک سوزن منفذدار، برای ظروفی مثل بطری های کشت خون، جهت جلوگیری از آلودگی با سرنگ) یک قطره از محیط کشت را روی لام قرار دهید.
برای جلوگیری از مخلوط شدن نمونه های مختلف روی یک لام ، توصیه می شود روی هر لام، یک گسترش تهیه شود.
- نمونه های برداشت شده از محیط های کشت جامد:
- یک قطره سرم فیزیولوژی استریل استریل روی لام قرار دهید.
- مقدار کمی از کلنی را با یک اپلیکاتور، آنس یا لوپ استریل بردارید.
- به آرامی مخلوط کنید تا سوسپانسیون یکنواختی حاصل گردد.
شکل ۲- نحوه تهیه گسترش از محیط کشت مایع |
ب- فیکس کردن گسترش:
مطابق روشهای که قبلا” توضیح داده شده است.گسترش های تهیه شده را تثبیت و فیکس می کنیم.
ج- روش انجام رنگ آمیزی گرم:
الف- روش هوکر Hucker’s modification
- رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام می ریزیم و می گذاریم یک دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند. پس از سپری شدن مدت زمان یک دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب شیر که با فشار کم در حال خارج شدن است، لام را به آرامی بشوئید.
احتیاط: شستشوی بیش از حد در این مرحله می تواند باعث شسته شدن کریستال ویوله از سلول های گرم مثبت شود. برای اطمینان از جریان آرام آب در سمت اسمیردار لام، اسلاید را به صورت زاویه دار نگه دارید.
- مرحله اضافه کردن محلول ید : چند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و می گذاریم بمدت یک دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب شیر همانند مرحله قبل ، لام را شستشو دهید.
- مرحله رنگ بری با استفاده از الکل- استون : با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استون که بر روی گستره می ریزیم بسرعت آنرا بی رنگ می کنیم. مرحله بی رنگ سازی ۲۰تا ۳۰ ثانیه باشد. بعد از آن لام را بسرعت می شوییم . این عمل ، بی رنگ شدن را متوقف خواهد کرد.
- رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین می پوشانیم و۳۰ ثانیه صبر می کنیم . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو می دهیم.
- خشک کردن: لام رنگ آمیزی شده را در وضعیت ایستاده در مجاورت هوا خشک کنید. پشت لام را با استفاده از دستمال کاغذی آغشته به استون یا الکل پاک کنید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.
- مشاهده و بررسی: مقداری از روغن را روی لام ریخته و لام را زیر میکروسکوپ بررسی و مشاهده می کنیم.
شکل ۳- مراحل رنگ آمیزی گرم |
کنترل کیفی:
الف- روزانه معرف ها را از نظر ظاهری بررسی کنید.
۱- اگر کریستال ویوله رسوب کرده یا ته نشین شده، قبل از استفاده آن را صاف کنید، حتی زمانی که معرف ها به صورت تجاری خریداری می شوند.
نکته: بعضی رنگ ها، خصوصاً فوشین بازی و سافرانین می توانند آلوده شوند. در صورت شک به آلودگی ، انجام رنگ آمیزی با استفاده از معرف تازه توصیه میگردد .
۲- تبخیر شدن مواد ممکن است کارایی و تأثیر معرف ها را دگرگون کند. اگر محلول های کاری با مصرف روزانه تمام نمی شوند، باید به طور منظم تعویض شوند.
ب- استفاده از سوش های استاندارد :
به طور روزانه در صورت زیاد بودن نمونه و یا زمانی که از یک کیت جدید و یا تازه تهیه شده استفاده می شود، گسترشی از اشریشیا کلی (ATCC 25922) و استافیلوکوک اپیدرمیدیس (ATCC 12228) و یا استافیلوکوک اورئوس (ATCC 25923) تهیه و فیکس نموده و مطابق روش فوق رنگ آمیزی کنیدو نتایج را بررسی نماید
نتایج مورد انتظار:
۱ – باسیل های گرم منفی، صورتی
۲- کوکسی های گرم مثبت، بنفش پررنگ
توجه: بعنوان روش کنترل کیفی جایگزین پیشنهاد میشود با یک اپلیکاتور چوبی از فلور میکروبی بین دندان ها نمونه برداری نموده و رنگ آمیزی نماییدزیرا در نمونه فوق الذکر هم ارگانیسم های گرم مثبت و هم گرم منفی وجود خواهد داشت.
گزارش نتایج در رنگ آمیزی گرم:
الف- نتایج و تفسیر
۱- وضعیت کلی اسمیر را با بزرگنمایی کم (۱۰× ) ارزیابی کنید.
- دقت نمایید که اسمیر بطور مناسبی رنگ بری شده باشد. بسته به نوع نمونه، زمینه عموما” باید شفاف یا صورتی باشد. اگر گلبول های سفید در نمونه وجود دارد، بایدبه صورت گرم منفی ظاهر شوند. رسوب های نازک سوزنی شکل کریستال ویوله را با باکتری های میله ای شکل گرم مثبت اشتباه نگیرید.
- دقت نمایید ضخامت اسمیر مناسب باشد. برای تفسیر مناسب، گستره نمی بایستی بیش از یک سلول ضخامت داشته و روی هم افتادگی سلول ها نباید مشاهده شود.
۲- اسمیرهای تهیه شده از نمونه های بالینی را جهت بررسی موارد زیر با بزرگنمایی کم بررسی کنید:
- مقادیر مربوط به نوتروفیل ها، مونوسیت ها و گلبول های قرمز
- مقادیر مربوط به سلول های اپی تلیال و باکتری های فلور نرمال که ممکن است نشانگر جمع آوری نامناسب نمونه باشد.
- وضعیت و آرایش میکروارگانیسم ها
۳- مناطق متعددی از اسمیر را با روغن ایمرسیون از نظر وجود میکروارگانیسم ها بررسی و به شیوه زیر گزارش کنید.
- در صورت عدم مشاهده هیچ گونه میکروارگانیزم در لام تهیه شده :”هیچ میکروارگانیسمی مشاهده نشد”.
- در صورت مشاهده میکروارگانیزمها ، تراکم کلی و مرفولوژی را شرح دهید.
۴- شکل سلولی غالب میکروارگانیسم ها را ذکر نمایید
- شکل کلی: کوکسی، کوکوئیدی، کوکوباسیل، باسیل، رشته ای شکل، شبه مخمر
- ظاهر انتهاها: کروی، شمعی شکل، مسطح، گرزی شکل، مقعر. برآمدگی کناره ها می تواند وجود اسپورها را پیشنهاد کند، اما می تواند به علت واکوئل ها، پلئومرفیسم، یا رنگ آمیزی نامنظم باشد.
- ظاهر کناره ها: موازی، تخم مرغی شکل (برآمده)، مقعر، نامنظم
- ماهیت محور تقارن: مستقیم، منحنی، فنری
- پلئومرفیسم (ناپایداری در شکل): عبارت توصیفی “دیفتروئید” یا “کورینه فرم” برای توصیف باسیل های گرم مثبت به کار می رود که چند شکلی، گرزی شکل یا نامنظم و بی قاعده هستند یا آرایش نرده ای یا زاویه دار دارند (اشکال VوL ).
- گسترش شاخه ای یا سلولی
ب- ثبت مشاهدات
هر آزمایشگاه باید سیاست گزارش دهی ویژه ای را تدوین کند. یافته های مهم بالینی باید جهت اطلاع به پزشک معالج اعلام شود.
برای نمونه ادرار ۲۰میدان میکروسکپی یا بیشتر را بررسی کنید. اگر بطور میانگین،ن یک ارگانیسم یا بیشتر در میدان میکروسکپی روغن ایمرسیون دیده می شود، مثبت گزارش کنید. این امر با کلنی کانت CFU/ml 105 ≤ همبستگی دارد.
مقادیر مربوط به سلول ها و میکروارگانیسم های مشاهده شده را گزارش دهید.
ج- گزارش دهی رنگ آمیزی گرم:
معمولا” سیستم های گزارش دهی می تواند کمی یا عددی باشد که بصورت زیر است.
۱) عددی
- +۱ ( کمتر از یک باکتری در هر میدان میکروسکپی روغن ایمرسیون ]×۱۰۰[)
- +۲ ( ۱ در فیلد روغن ایمرسیون)
- +۳ ( ۲ تا ۱۰ در فیلد روغن ایمرسیون)
- +۴ ( غالب یا ۱۰< در فیلد روغن ایمرسیون)
۲) توصیفی
- کمیاب: کمتر از یک باکتری در فیلد روغن ایمرسیون)
- کم: (۱ تا ۵ در فیلد روغن ایمرسیون)
- متوسط: (۵ تا ۱۰ در فیلد روغن ایمرسیون)
- زیاد: (۱۰< در فیلد روغن ایمرسیون)
مرفولوژی باکتری های مشاهده شده را ثبت کنید.
نکات مهم در رنگ آمیزی گرم:
- حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.
- اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یک گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.
- غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .
- رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.
- دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید ۲۴ ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد
- نتایج رنگ آمیزی گرم می بایستی در تطابق با سایر یافته های بالینی و آزمایشگاهی مورد استفاده قرار گیرد.
- برای کسب نتایج صحیح، پیروی دقیق از روش انجام آزمایش و معیارهای تفسیر الزامی می باشد. صحت، ارتباط زیادی با آموزش و مهارت شخص مشاهده کننده اسلاید دارد.
- مشاهده میکروارگانیزم های گرم مثبت و نمونه های کشت منفی ممکن است در نتیجه آلودگی معرف ها و سایر لوازم، حضور عوامل ضدمیکروبی، یا کاهش رشد ارگانیسم ها تحت شرایط کشت معمول (محیط کشت ، اتمسفر و غیره) باشد.
- نتایج نادرست رنگ آمیزی گرم ، ممکن است مربوط به کیفیت نامناسب جمع آوری نمونه باشد.
- ممکن است گاهی واکنش رنگ آمیزی گرم با کلنی های خیلی تازه در مقایسه با کلنی های کهنه تر متفاوت باشد. وقتی که اسمیرها از ساب کالچر ۲۴ – ۱۸ ساعته تهیه می شوند (زمانی که سلول های باکتریایی در فاز لگاریتمی رشد هستند)، مرفولوژی اغلب باکتری ها در رنگ آمیزی گرم، در بهترین شرایط می باشد.
باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند:
برخی از باکتریها همانند مایکو باکتریوم توبرکلوزیس با رنگ آمیزی گرم میانه خوبی ندارند و برای تشخیص و مشاهده از روشها و رنگ آمیزی های خاصی استفاده می شود. مثلا” برای تشخیص مایکو باکتریوم توبرکلوزیس از رنگ آمیزی اختصاصی ذیل – نیلسون که یک رنگ آمیزی اختصاصی برای باکتری های مقاوم به اسید است.
| نام باکتری | علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم | روش رنگ آمیزی جایگزین |
| مایکو باکتریوم ها مثل مایکو باکتریوم توبرکلوزیس | وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می کند | رنگ امیزی اسید فاست |
| ترپونما پالیدوم | نازکتر از آن است که دیده شود | میکروسکوپ زمینه تاریک یا آنتی بادی فلوئورسنت |
| مایکوپلاسما پنومونیه | نبود دیواره سلولی | روشی وجود ندارد |
| لژیونلا پنوموفیلا | عدم دریافت رنگ قرمز | طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ امیزی گرم |
| کلامیدیا ها از جمله کلامیدیا تراکوماتیس | وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول | …………… |
| ریکتزیا ها | وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول | رنگ آمیزی گیمسا یا سایر رنگ آمیزی های بافتی |
| جدول ۱- باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند |
ب- رنگ آمیزی گرم به روش carbol-fuchsin Basic
از این روش برای شناسایی ارگانیسم های گرم منفی که رنگ کمی گرفته اند به کار می رود.
ج- رنگ آمیزی گرم به روش Kopeloff’s modification
برای مشاهده و افتراق بهتر بی هوازیها توصیه می شود از روش رنگ آمیزیKopeloff’s modification استفاده شود.
