رنگ‌آمیزی گرم یکی از مهم ‌ترین و متداولترین روش‌های رنگ آمیزی در علم میکروب شناسی است که برای اولین بار در سال ۱۸۸۴ توسط پزشک و میکروب شناس دانمارکی بنام هانس کریستین  گرم (Hans Christian Gram ) موقع رنگ آمیزی  برای متمایز کردن باکتریهای مولد ذات الریه از هسته سلولهای میزبان ابداع شد . این رنگ آمیزی که مهمترین و کاربردی ترین رنگ آمیزی افتراقی میکروب شناسی است . در حالت کلی باکتری ها را به دو دسته یا گروه بزرگ گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می کند در سال ۱۹۲۱هوکر (George J. Hucker)  میکروب شناس آمریکایی با اصلاحات جزئی در روش رنگ آمیزی گرم ارتقاء و بهبود این روش شد. در آزمایشگاه میکروب شناسی بالینی، رنگ آمیزی گرم آزمایشی مهم برای تشخیص احتمالی سریع عوامل عفونی است. این آزمایش برای طبقه بندی باکتری ها بر اساس شکل، اندازه، مورفولوژی سلول و واکنش گرم آنها به کار می رود.

اساس روش رنگ آمیزی گرم، ناشی از تفاوت ساختاری در یواره سلولی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت است. به این ترتیب که ضخامت لایه پپتیدوگلیکان (ترکیب اصلی دیواره سلولی) در باکتریهای گرم مثبت خیلی بیشتر از باکتریهای گرم منفی می باشد لذا اساس رنگ آمیزی گرم به ساختمان و ترکیب دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . در این روش ابتدا رنگ بازی کریستال ویوله بکار می رود که همه باکتریهای کشته شده و تثبیت شده بر روی لام آن را جذب می نمایند و سپس محلول رقیق ید به عنوان دندانه (Mordant) افزوده می شود که رسوبی از کمپلکس کریستال ویوله  و ید در پروتوپلاسم تشکیل می دهد.  در مرحله بعدی رنگ آمیزی وقتی که از  رنگبر استفاده می شود در باکتری های گرم مثبت ساختار شیمیایی اصلی دیواره، یعنی پپتیدوگلیکان، لایه ای ضخیم است و پس از متراکم شدن در اثر آبگیری با رنگبری، نفوذناپذیر شده و مانع از خروج کمپلکس کریستال ویوله و ید از سلول می شود. ولی در دیواره سلولهای گرم منفی، پپتیدوگلیکان لایه ظریفی از دیواره را تشکیل می دهد و بقیه دیواره از جنس چربی هاست که در رنگبر حل شده و از بین می رود و لذا امکان رخنه افزایش یافته و کمپلکس کریستال ویوله ید به راحتی از پروتوپلاسم شسته شده و از سلول خارج می شود. تا بدین مرحله گرم منفی ها بی رنگ شده و گرم مثبت ها همچنان بنفش باقی مانده اند.

در مرحله پایانی رنگ آمیزی، از رنگ ثانویه یا رنگ مخالف  (Counterstain) استفاده می شود و باکتری های گرم منفی که کمپلکس رنگی خود را از دست داده اند در نتیجه افزودن رنگ قرمز سافرانین، قرمز رنگ می شوند )گرم منفی(. ولی باکتری هایی که در اثر افزودن رنگبر (Decolorizer)، رنگ خود را از دست نداده اند با افزودن رنگ سافرانین، همچنان رنگ قبلی یعنی بنفش را نگه داشته و نشان می دهند )گرم مثبت(..

اکثر باکتریهای شناخته شده ، گرم منفی هستند البته برخی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.

تفسیر گسترش هایی که رنگ آمیزی گرم شده اند، با در نظر گرفتن مشخصه های رنگ آمیزی ، اندازه، شکل و آرایش سلول صورت می گیرد. این مشخصه ها ممکن است بوسیله بسیاری از فاکتورها مانند مدت زمان ماندگی باکتری در محیط کشت، نوع محیط کشت، اتمسفر انکوباسیون، روش رنگ آمیزی و وجود مواد مهارکننده تحت تأثیر قرار بگیرند. برای تفسیر اسمیرهای تهیه شده از نمونه های بالینی مانند خلط، به وجود عوامل اضافی مانند انواع سلول های میزبان و فاگوسیتوز نیز می بایست دقت نمود .

 

شکل ۱- تفاوت ساختاری دیواره سلولی باکتری های گرم منفی و گرم مثبت

اسمیر برای رنگ آمیزی گرم ممکن است از نمونه های بالینی، محیط براث یا کلنی های رشد کرده روی محیط کشت جامد تهیه شود. نمونه های بالینی تازه وکشت های تازه (کمتر از ۲۴ ساعت) از محیط های غیرمهارکننده ، صحیح ترین نتایج را می دهند؛برای برخی بررسی های مورفولوژیکی، اسمیر تهیه شده از کشت براث مورد نیاز می باشد.

معرف ها ممکن است به صورت تجاری خریداری شوند یا در آزمایشگاه تهیه گردند.

طرز تهیه:

محلول ذخیره و مصرفی کریستال ویوله، در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری می‌شود.

تهیه اگزالات آمونیوم                                    

هنگام مصرف، محلول کریستال ویوله ذخیره را به نسبت ۱:۱۰ با آب‌ مقطر رقیق ‌نمایید. (۱ میلی لیتر از محلول کریستال ویوله و ۹  میلی لیتر آب‌ مقطر) سپس این محلول را با چهار حجم از محلول اگزالات آمونیم رقیق کنید (۱ میلی لیتر محلول کریستال ویوله رقیق شده و ۴ میلی لیتر اگزالات آمونیم).

روش تهیه:

احتیاط: ید خاصیت خورندگی دارد. از استنشاق، خوردن یا تماس آن با پوست خودداری کنید.

حجم مساوی از الکل اتیلیک (اتانول) را با استون بسته به نیاز مخلوط نمایید. مثلا” مخلوطی از ml 100 اتانول و  ml100 استون را در بطری شیشه ای قهوه ای رنگ ترکیب کنید، با یک سال تاریخ انقضاء، برچسب بزنید و در حرارت اتاق نگهداری کنید.

روش تهیه فوشین ذخیره:

روش تهیه سافرانین ذخیره:

به هنگام مصرف، محلول ذخیره فوشین یا محلول ذخیره سافرانین را به نسبت ۱:۱۰ با آب‌ مقطر رقیق نمایید. محلولها در ظروف تیره، تهیه و در دمای اتاق ذخیره می شوند.

نکته: متانول را در بطری های درپیچ دار قهوه ای ذخیره کنید. ذخیره کاری را می توان در ظروف پلاستیکی برای حداکثر دو هفته ذخیره نمود .

 

 

 

 

روش انجام آزمایش:

الف–  تهیه گسترش :

اسمیر مناسب باید لایه ای از ارگانیسم ها با تراکم مناسب برای مشاهده آسان ایجاد نماید. پراکندگی ارگانیسم ها می بایست به نحوی باشد که آرایش آنها مشخص شود. برای تهیه اسمیر از لام های شیشه ای نو و تمیز استفاده نمایید.

نکته: زمانی که از یک پی پت یا سواب برای تهیه اسمیر و تلقیح محیط کشت استفاده می کنید، همیشه قبل از تهیه اسمیر، ابتدا محیط کشت را تلقیح کنید.

۱– نمونه های بالینی برای رنگ آمیزی گرم:

نکته : استفاده از دستکش لاتکس در زمان کار روی نمونه های بالینی ضروری است .

در اینگونه موارد بهتر است یک سواب جداگانه برای تهیه اسمیر آماده شود .

الف- جهت جلوگیری از تخریب عناصر سلولی و از بین رفتن آرایش باکتریایی، به آرامی سواب را در سرتاسر لام بچرخانید.

نمونه هایی که با سواب دریافت نمی شوند شامل: آسپیره ها، ترشحات، چرک، مدفوع

نکته: سرنگ های همراه سرسوزن را ، نپذیرید. به کارکنان مربوطه جداسازی ایمن سرسوزن ها را آموزش دهید .

بعضی از آزمایشگاهها ممکن است برای تغلیظ مایعات بدن و تهیه اسمیر از Cytopsin Slide Centrifuge استفاده کنند. این روش به افزایش حساسیت رنگ گرم ،کاهش زمان سانتریفوژ و دسترسی سریعتر به نتیجه کمک می نماید.

بدون سانتریفوژ کردن نمونه را به خوبی مخلوط کرده با استفاده از یک پی پت پاستور استریل یک قطره از آن را روی لام قرار دهید و قطره را پخش نکنید. اجازه دهید قطره در مجاورت هوا خشک شود.

مواد خشک یا مقادیر خیلی کم نمونه های بالینی:

 

تهیه نمونه حاصل از تماس مستقیم اسلاید با سطح نمونه (touch prep) و یا نمونه خرد شده (ground specimen)

پس از مخلوط کردن محیط کشت با استفاده از پی پت پاستور استریل (یا یک سوزن منفذدار، برای ظروفی مثل بطری های کشت خون، جهت جلوگیری از آلودگی با  سرنگ) یک قطره  از محیط کشت را روی لام قرار دهید.

برای جلوگیری از مخلوط شدن نمونه های مختلف روی یک لام ، توصیه می شود روی هر لام، یک گسترش تهیه شود.

شکل ۲- نحوه تهیه گسترش از محیط کشت مایع

ب- فیکس کردن گسترش:

مطابق روشهای که قبلا” توضیح داده شده است.گسترش های تهیه شده را تثبیت و فیکس می کنیم.

ج- روش انجام رنگ آمیزی گرم:

الف-  روش هوکر  Hucker’s modification

 احتیاط: شستشوی بیش از حد در این مرحله می تواند باعث شسته شدن کریستال ویوله از سلول های گرم مثبت شود. برای اطمینان از جریان آرام آب در سمت اسمیردار لام، اسلاید را به صورت زاویه دار نگه دارید.

شکل ۳- مراحل رنگ آمیزی گرم

کنترل کیفی:

الف-  روزانه معرف ها را از نظر ظاهری بررسی کنید.

۱-  اگر کریستال ویوله رسوب کرده یا ته نشین شده، قبل از استفاده آن را صاف کنید، حتی زمانی که معرف ها به صورت تجاری خریداری می شوند.

نکته: بعضی رنگ ها، خصوصاً فوشین بازی و سافرانین می توانند آلوده شوند. در صورت شک به آلودگی ،  انجام رنگ آمیزی با استفاده از معرف تازه توصیه میگردد .

۲- تبخیر شدن مواد ممکن است کارایی و تأثیر معرف ها را دگرگون کند. اگر محلول های کاری با مصرف روزانه تمام نمی شوند، باید به طور منظم تعویض شوند.

ب- استفاده از سوش های استاندارد :

به طور روزانه در صورت زیاد بودن نمونه و یا زمانی که از یک کیت جدید و یا تازه تهیه شده استفاده می شود، گسترشی از اشریشیا کلی (ATCC 25922) و استافیلوکوک اپیدرمیدیس (ATCC 12228) و یا استافیلوکوک اورئوس (ATCC 25923) تهیه و فیکس نموده و مطابق روش فوق رنگ آمیزی کنیدو نتایج را بررسی نماید

 نتایج مورد انتظار:

۱ – باسیل های گرم منفی، صورتی

۲- کوکسی های گرم مثبت، بنفش پررنگ

توجه: بعنوان روش کنترل کیفی جایگزین پیشنهاد میشود با یک اپلیکاتور چوبی از فلور میکروبی بین دندان ها نمونه برداری نموده و رنگ آمیزی نماییدزیرا در نمونه فوق الذکر هم ارگانیسم های گرم مثبت و هم گرم منفی وجود خواهد داشت.

گزارش نتایج در رنگ آمیزی گرم:

الف- نتایج و تفسیر

۱- وضعیت کلی اسمیر را با بزرگنمایی کم (۱۰× ) ارزیابی کنید.

۲- اسمیرهای تهیه شده از نمونه های بالینی را جهت بررسی موارد زیر با بزرگنمایی کم بررسی کنید:

۳- مناطق متعددی از اسمیر را با روغن ایمرسیون از نظر وجود میکروارگانیسم ها بررسی و به شیوه زیر گزارش  کنید.

۴- شکل سلولی غالب میکروارگانیسم ها را ذکر نمایید

ب-  ثبت مشاهدات

هر آزمایشگاه باید سیاست گزارش دهی ویژه ای را تدوین کند. یافته های مهم بالینی باید جهت اطلاع به پزشک معالج اعلام شود.

برای نمونه ادرار ۲۰میدان میکروسکپی یا بیشتر را بررسی کنید. اگر بطور میانگین،ن یک ارگانیسم یا بیشتر در میدان میکروسکپی روغن ایمرسیون دیده می شود، مثبت گزارش کنید. این امر با کلنی کانت CFU/ml 105 ≤ همبستگی دارد.

مقادیر مربوط به سلول ها و میکروارگانیسم های مشاهده شده را گزارش دهید.

ج- گزارش دهی رنگ آمیزی گرم:

معمولا” سیستم های  گزارش دهی می تواند کمی یا عددی باشد که بصورت زیر است.

۱) عددی

۲) توصیفی

مرفولوژی باکتری های مشاهده شده را ثبت کنید.

 

 

 

 

 

نکات مهم در رنگ آمیزی گرم:

 

 

 

 

 

 

 

باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند:

برخی از باکتریها همانند مایکو باکتریوم توبرکلوزیس با رنگ آمیزی گرم میانه خوبی ندارند و برای تشخیص و مشاهده از روشها و رنگ آمیزی های خاصی استفاده می شود. مثلا” برای تشخیص مایکو باکتریوم توبرکلوزیس از رنگ آمیزی اختصاصی ذیل – نیلسون که یک رنگ آمیزی اختصاصی برای باکتری های مقاوم به اسید است.

نام باکتری علّت عدم مشاهده باکتری با روش گرم روش رنگ آمیزی جایگزین
مایکو باکتریوم ها مثل مایکو باکتریوم توبرکلوزیس وجود مقدار زیادی چربی در دیواره سلولی که از نفوذ رنگ جلوگیری می کند رنگ امیزی اسید فاست
ترپونما پالیدوم نازکتر از آن است که دیده شود میکروسکوپ زمینه تاریک یا آنتی بادی فلوئورسنت
مایکوپلاسما پنومونیه نبود دیواره سلولی روشی وجود ندارد
لژیونلا پنوموفیلا عدم دریافت رنگ قرمز طولانی نمودن مرحله افزودن سافرانین در رنگ امیزی گرم
کلامیدیا ها از جمله کلامیدیا تراکوماتیس وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول ……………
ریکتزیا ها وجود ارگانیسم های درون سلولی، کوچکی سلول رنگ آمیزی گیمسا یا سایر رنگ آمیزی های بافتی
جدول ۱- باکتری های مهم از نظر پزشکی که با رنگ آمیزی گرم قابل مشاهده نیستند

 

ب- رنگ آمیزی گرم به روش carbol-fuchsin Basic

از این روش برای شناسایی ارگانیسم های گرم منفی که رنگ کمی گرفته اند به کار می رود.

ج- رنگ آمیزی گرم به روش Kopeloff’s modification

برای مشاهده و افتراق بهتر بی هوازیها توصیه می شود از  روش رنگ آمیزیKopeloff’s modification استفاده شود.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *